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反义寡核苷酸——新型抗菌药物的曙光

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-11-06 13:47  浏览次数:18
反义寡核苷酸——新型抗菌药物(http://www.chemdrug.com/)的曙光



1反义RNA的发现和研究历程

天然反义RNA是一类分子质量较小的多聚寡核苷酸,它们与生物体双链DNA的正义链或mRNA的一段序列互补。最早是由E.Coli体内质粒复制的调控而发现的。原核生物中反义RNA抑制基因表达的方式有三种:(1)DNA复制水平: 反义RNA与引物前体结合,阻止正常引物的产生,使DNA复制不能进行。(2)转录水平:反义RNA与mRNA 5′端结合,形成类似于转录终止信号的Ⅱ级结构;(3)翻译水平:又分为两种方式,即反义RNA与mRNA SD序列和/或编码起始区结合,直接抑制翻译或与mRNA非编码区结合,使mRNA分子构象发生改变而不能与核糖体结合,间接抑制翻译。反义RNA可由人工合成(http://www.chemdrug.com/article/8/)及反以表达载体两种方式得到。后者是利用基因重组技术,在适当的启动子和转录终止子间反向插入一段靶基因,所得到的、反义表达的RNA可抑制同源基因的表达,效果稳定、持久。人工合成的反义寡核苷酸包括反义RNA和反义DNA, 通常由15~20个核苷酸组成,为防止细胞内核酸酶的分解作用,常将其进行化学修饰。将他们运送到靶细胞,只产生短效应,不会留下长效的遗传效应,这对于前期研究尚未探明其副作用的前提下,有较好的安全性;其用量及作用的靶序列可以人为控制,原则上不会干扰其它基因结构和它们自身正常的调控方式;尤其是反义寡核苷酸不会产生耐药性,还可采用多点反义处理增强抑制效果。反义RNA的基因沉默功能不仅可以用来研究未知基因功能,而且可用于多种疾病的治疗。自Zammeenik等首次报道以反义寡核苷酸抑制劳氏肉瘤病毒复制后,反义寡核苷酸便迅速应用于肿瘤、病毒感染、寄生虫病的研究。Liu song-kai等分别利用反义RNA和siRNA抑制HIV-1复制过程中所需细胞蛋白CyPA的合成,结果均明显抑制了HIV-1在人T淋巴细胞中的复制;他们认为两种方法机制不同,靶向部位不同,联合使用可增强抑制效果[1]。Ji Yinduo等通过构建针对金黄色葡萄球菌脂肪酸合成酶的反义表达载体,转染该菌后发现能抑制编码基因的表达,使其生长受到明显抑制,甚至停止[2]。

反义技术应用于临床治疗也屡有报道:如利用人工合成的反义寡核苷酸抑制C-myc等致癌基因或肿瘤生长因子的表达等。



2反义RNA作用的双重性

反义RNA不仅可以作为基因表达的负调节因子,也可以作为正调节因子。例如:mRNAⅡ级结构的形成有时会抑制其翻译,设计阻止mRNAⅡ级结构形成的反义RNA可促进基因的表达。我们知道生物体内某个基因表达不足或表达过度均会造成生物体的疾病。如细胞凋亡基因受促凋亡基因及抑凋亡基因的控制;正常表达时,在胚胎发育中可清除对机体无用的甚至有害的细胞,使组织器官结构正常、形态完整;在成年机体去除衰老、损伤、癌变的细胞,并代之以新生的细胞,以维持器官中细胞数量稳定和机体防御系统完整。若凋亡基因表达不足,导致细胞凋亡受阻,会逐步发展成肿瘤;若表达过度,则造成组织器官发育缺陷或功能降低,进而导致机体产生一系列的病变。靶向促凋亡基因的反义RNA可抑制细胞凋亡;反之,则促进细胞凋亡。由此我们可以看出,虽然反义RNA的作用是抑制同源基因的表达,但是由于靶目标的不同,抑制结果却截然相反。这就要求我们以全面系统的态度对待反义RNA。



3目前存在的问题及解决方法

3.1转染效率:无论是载体表达的反义RNA还是体外合成的反义寡核苷酸,只有进入靶细胞,才可与同源基因结合,发挥调节作用,而且反义RNA调节具有明显的剂量依赖性。裸露的反义寡核苷酸进入细胞是一个内化过程,效率很低;而带有极性的反义寡核苷酸则是一个主动吸收过程,效率相对较高。然而,截至目前这一问题仍是反义RNA开发应用中的最大瓶颈。细菌由于其特殊的细胞壁结构,转染效率更低于真核细胞,这也是自反义RNA发现以来,较少用于原核细胞之原因所在。分子生物学技术的发展及各种运送载体的出现和改进,如利用脂质体等介导反义分子;电转染;噬菌体运用;改造反转录病毒,使其毒性降低,继而携带反义分子进入靶细胞等方法已使转染效率明显提高。Patrick 等用阴性电荷的脂质体包裹针对lacZ基因的反义寡核苷酸转染大肠杆菌,结果显示有57 %的大肠杆菌整合了包裹的反义寡核苷酸(游离反义寡核苷酸的整合率几乎为零),并且测得β-半乳糖苷酶的活力下降了42%[3]。相信通过多学科联合开发,以科学哲学的方法论和系统方法为指导,这一问题最终能得到解决。

3.2靶序列的选择:许多研究结果表明:一些基因的反义沉默效果比另一些基因的好;同一基因,不同靶序列的沉默效果不同。靶序列的选择除根据上述反义寡核苷酸的作用机制外,目前一定程度上依靠经验,不能完全由分析(http://www.chemdrug.com/sell/76/)基因组来确定。真核细胞反义RNA的研究经历了二十余年,积累了较为丰富的经验,可用来指导原核细胞反义序列的设计。为了达到抑制、杀灭细菌或阻止其致病基因表达的目的,研究者一方面应遵循系统方法论的最优化原则,选择靶基因、确定靶序列时,要统筹兼顾、整体协同,在多种方案中权衡得失,优化选择;另一方面应本着科学精神,展开科学活动,及时归纳、总结,逐步完善设计原则,推动新型抗菌药的研发,争取早日用于临床。

3.3给药途径:药物在机体内须达到一定的量并维持一定的时间才能发挥其药理作用。也就是说,药物首先应能耐受机体某些酶的作用而不被分解,安全抵达靶细胞,同时对非目标组织器官无毒副作用。事实上,目前尚无同时达到这两项要求的药物。俗话说:是药三分毒。

这就要求我们把握系统与要素、要素与要素之间的相互影响、相互制约和相互作用,把握事物整体性质及组成系统各要素间的联系,寻找最优结构,获得最佳功能。研究靶细胞的特异受体,选择具有识别性能的配体,将反义分子连接在配体上,使反义分子准确进入靶细胞就是对这一原则的最好诠释。



4反义RNA作为新型抗菌药物的可能性:感染性疾病是由于病源菌在体内生长、繁殖或机体正常菌群失调造成的。细菌本身的某些成份和/或生长代谢过程中产生的某些物质对特定组织器官具有毒性作用,这些毒性物质就是致病菌的毒力因子。核酸序列分析技术的迅猛发展,使探明编码毒力因子的基因序列不成问题。根据基因序列设计相应的反义RNA,借助运送载体转入细菌细胞内,抑制致病基因或编码细菌生长所必需的蛋白质基因的表达,可以达到减毒、抑制或杀灭细菌的目的。这些反义分子是最具潜能的新型抗生素。Harth等针对结核分枝杆菌致病谷氨酰胺合成酶的mRNA设计了三条硫代修饰的反义寡核苷酸,通过加入到培养液共培养,检测(http://www.chemdrug.com/sell/76/)到其合成酶活性降低、细菌胞壁中的L-谷胺酸/谷氨酰胺的比例下降了24%,两或三种反义寡核苷酸联合使用可增强抑制效果[4]。White,D.G.等应用靶向抗生素抗性基因启动子的反义DNA类似物,经热休克和电穿孔引入E.coli,抑制了抗性基因的表达,证明外源性寡核苷酸的抑制效果[5]。还有研究者用四环素诱导载体表达反义RNA,使致病菌致病基因表达明显下降,并用鼠的急、慢性感染试验(http://www.chemdrug.com/sell/24/)证实了这一点[6]。这些研究为将反义寡核苷酸开发成新型抗菌药物奠定了理论和实验基础。动态追踪各相关学科的发展,充分加以吸收和利用,是此研究目标不断发展、进步的基础;只有用运动、变化、发展的观点看待系统,看待要素,运用系统运动的基本规律,才能更好的认识、把握和达到研究目标。



参考文献:

[1]Songkai Liu, Maria Asparuhova, Vincent Brondani et al.2004. Inhibition of HIV multiplication by antisense U7 snRNA and siRNA targeting cyclophilinA[J]. Nucleic Acids Research,2004,32(12):3 752-3 795.

[2]Yinduo Ji, Dezhong Yin, etc.Validation of antibacterial mechanism of action using regulated antisense RNA expression in Staphylococcus aureus[J]. FEMS Microbiolgy Letters,2004,231:177-184.

[3]Patrick Fillion, Annie Desjardins, Khampoune Sayasith et al,2001.Encapsu lation of DNA in negatively charged liposome and inhibition of bacterial gene expression with fluid liposome-encapsu lated antisense oligonucleotides[J].Biochimica et Biophysica Acta,2001,1515: 44-54.

[4]Gunter Harth, Paul C. Zamecnik, Jin-Yan Tang, et al.Treatment of M ycobacterium tuberculosis with antisense oligonucleotides to glutamine synthetase mRNA inhibits glutamine synth etase activity, formation of the poly-L-glutamateyglutamine cell wall structure and bacterial replication[J].PNAS,2000,Vol(1):418-423.

[5]WHITE D G,MANEEWANNAKUL K,HOFE E.von et al.Inhibition of the multip le antibiotic resistance (mar) operon in Escherichia coli by antisense DNA analo gs. Antimicrobial. Agents and chemotherapy,1997,12:2 699-2 704.

[6]Yindao ji, Andrea marra,Martin Rosenberg, et al.Regulated antisense RNA eliminiates Alpha-Toxin virulence in Staphylococuus aureus infection[J]. Journ al of bacteriology,1999,6 585-6 590.


 
 
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