关注:14 2019-03-11 16:14

没有合适的一抗做免疫沉淀怎么办?

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IP的整个过程需要用到的关键工具有:

一抗:选择能与我的样本发生反应,能做IP实验的一抗; 

Potein A,Potein G或Protein A /GPotein A,Potein G及Protein A /G与不同来源及亚型的免疫球蛋白结合能力不一样,如何选择?请参考https://www.abbkine.com/affinity-of-protein-a-protein-g-and-protein-ag/

选择指南

货号

产品名称

BMR20500

PurKine™ Protein A Resin

BMR20504

PurKine™ Protein A Resin 4FF

BMR20600

PurKine™ Protein G Resin

BMR20604

PurKine™ Protein G Resin 4FF

BMR20704

PurKine™ Protein A/G Resin 4FF

第二步:发现竟然没有合适的一抗来满足我需要做的免疫沉淀?

某些目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀,如抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽,无法与目的蛋白相互作用或抗体选择不合适,所选抗体不能识别处于天然构象的蛋白等,可以采用一个表位标记蛋白后,再选择针对此表位的标签抗体来进行免疫沉淀。厂家会推出一些常见的标签抗体用于IP实验,涉及flag、HA、His、Myc等标签,以满足大多数客户的需求。

特别是琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体,能*大限度优化免疫沉淀实验,节省时间和成本。

 1)原理:省去了Protein A/G与抗原-抗体复合物结合的步骤,且解决了Protein A/G和抗体结合能力弱的问题。偶联抗体直接和目标蛋白结合后,通过离心或使用磁力架,将目标蛋白从细胞裂解液中分离出来。高特异性单克隆标签抗体可实现高产量和高纯度,稳定、预封闭的填料及特异性抗体减少了免疫沉淀过程中的非特异性结合。

(琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体应用于IP)

2)选择指南

 

货号

产品名称

A02010AGB

Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Agarose

A02010MGB

Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Magnetic Beads

A02040AGB

Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Agarose

A02040MGB

Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Magnetic Beads

A02050AGB

Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Agarose

A02050MGB

Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Magnetic Beads

A02060AGB

Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Agarose

A02060MGB

Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Magnetic Beads

第三步:免疫沉淀后WB (IP-WB)出现重链、轻链干扰,怎么办?

在免疫沉淀实验后的WB验证环节中,当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时,通常会出现对应免疫沉淀一抗变性后产生的重链(50kDa)和轻链(25kDa)两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时,就会受到这两条带的干扰。如何避免干扰,

方法一:选择只和重链或轻链反应的二抗。如果目标蛋白分子量小于30KD,为了避免抗体轻链的干扰,选择重链特异性二抗;如果目标蛋白分子量大于30KD,为了避免抗体重链的干扰,选择轻链特异性二抗;

选择指南:

 

货号

产品名称

描述

A25012

IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS

轻链特异性

A25022

IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS

轻链特异性

A25112

IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG HCS

重链特异性

A25222

IPKine™ HRP, Goat Anti-Rabbit IgG HCS

重链特异性

“使用IPKine Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 轻链特异性二抗检测NUP50蛋白的IP结果,**解决重链干扰问题! ” CAT #: A25022

   

方法二:选择WB一抗时,选择和IP用一抗不同的种属,避免IP一抗的干扰;

方法三:选择HRP直接偶联的WB一抗,省去二抗的步骤。