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含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

放大字体  缩小字体 更新日期:2018-11-21  浏览次数:5
摘 要:目的 构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1 Tatl0l蛋白编码基因从pEN质粒中切出,插入到表达质粒IZRSpBMN-Z中,
  • 【题 名】含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测
  • 【作 者】卢春 黄丽 曾怡
  • 【机 构】南京医科大学微生物学与免疫学系,210029
  • 【刊 名】《中华微生物学和免疫学杂志》 2003年第23卷第9期,691-695页
  • 【关键词】HIV-1Tat 基因重组 反转录病毒表达载体 表达 Tat蛋白 检测 转录激活
  • 【文 摘】目的 构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1 Tatl0l蛋白编码基因从pEN质粒中切出,插入到表达质粒IZRSpBMN-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tat101。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染φNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清,并分别感染293细胞,Western blot检测Tat在293中表达。与此同时,收集感染293细胞培养上清,加入到HL3T1细胞(HeLa-HIV-1-LTR/CAT报告基因)中,共培养72h后收集细胞,提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后,Tat在临时转染φNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平;②临时转染病毒感染293细胞,Tat在感染细胞中得到了表达,且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子,使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白,且表达蛋白具有转录激活功能。
 
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