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CD59分子W40位点基因缺失的构建与活性检测

放大字体  缩小字体 更新日期:2018-11-21  浏览次数:8
摘 要:目的:构建突变型CD59重组质粒,建立高效真核表达系统,探讨W40位点的生物学活性。方法:采用基因点突变技术使CD5 9W40基因位置缺失,各设计两条互补突变引物和两条常规引物,以已构建的CD59 c
  • 【题 名】CD59分子W40位点基因缺失的构建与活性检测
  • 【作 者】朱新红 高美华 王秋波 任书荣 王静 张艳丽 张丽
  • 【机 构】青岛大学医学院免疫学教研室,青岛266071
  • 【刊 名】《中国免疫学杂志》 2008年第24卷第4期,295-299页
  • 【关键词】CD59 基因突变 真核表达 OverlapPCR 补体
  • 【文 摘】目的:构建突变型CD59重组质粒,建立高效真核表达系统,探讨W40位点的生物学活性。方法:采用基因点突变技术使CD5 9W40基因位置缺失,各设计两条互补突变引物和两条常规引物,以已构建的CD59 cDNA为模板,三重PCR(Overlap PCR)定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18-T-Vector,EcoRⅠ单酶切野生型和突变型CD59基因,重组入真核表达质粒pIRES,利用阳离子脂质体(Lipfectamine2000)将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达。结果:通过PCR定点诱变成功获得目的CD59突变基因MCD59,酶切鉴定及序列测定证实成功构建了pIRES-MCD59,转染CHO细胞,G418筛选出了稳定细胞克隆,检测筛选MCD59蛋白高表达株。免疫组化、免疫荧光、SDS-PAGE、ELISA验证CD59的表达;荧光染料释放试验研究显示与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能。结论:CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。
 
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  • (1) CD59,基因突变,真核表达,OverlapPCR,补体
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