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Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用

放大字体  缩小字体 更新日期:2018-11-21  浏览次数:16
摘 要:目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究。方法:PCR扩增Orai2 CDS编码
  • 【题 名】Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用
  • 【作 者】夏孝强 崔义元 李芳华 陈米娜
  • 【机 构】四川大学华西医院/生物治疗国家重点实验室神经分子生物学实验室,成都610041
  • 【刊 名】《中国免疫学杂志》 2009年第25卷第11期,965-968页
  • 【关键词】Orai2 多克隆抗体 过表达 内源性 敲除小鼠鉴定
  • 【文 摘】目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究。方法:PCR扩增Orai2 CDS编码序列,亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核表达载体上,将编码Orai2的pGEX-6p-1-Orai2重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Orai2融合蛋白表达,经固化的谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩,获得用于免疫的高纯度GST-Orai2融合蛋白。SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,按常规方法免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blot检测抗体效价和特异性,并进行Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织鉴定。结果:经亲和纯化后的GST-Orai2融合蛋白纯度较高,BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度约0.35 mg/ml。抗Orai2多抗抗体效价达1∶10 000。能特异性识别转染真核细胞获得的过表达Orai2,以及小鼠脑组织内源性的Orai2蛋白,而不与Orai1发生交叉反应。同时,用自制的Orai2多克隆抗体检测发现,与同窝野生型小鼠相比,Omi2条件性基因敲除小鼠脑组织中Orai2蛋白表达明显降低。结论:成功表达并纯化了GST-Omi2融合蛋白,获得了高敏感度、特异性的抗Orai2蛋白的多克隆抗体,该抗Omi2多抗能特异性识别过表达的和小鼠脑组织内源性Omi2蛋白,能对Omi2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织进行鉴定,且与Orai1没有交叉反应,为进一步研究Orai2功能奠定了基础。
 
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