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含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用

放大字体  缩小字体 更新日期:2018-11-24  浏览次数:3
摘 要:目的构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和融合型自杀基因Fcy::Fur的重组真核表达质粒并探讨它对卵巢癌细胞的体外杀伤作用。方法①从pORF5-Fcy::Fur质粒中PCR扩增Fcy::Fur
  • 【题 名】含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用
  • 【作 者】朱元方 李攀 康楷 胡丽娜 乐爱文 汤雄文 杨环
  • 【机 构】重庆医科大学附属第二医院妇产科 重庆400010 重庆医科大学超声影像学研究所 重庆400016 重庆医科大学附属第一医院院妇产科 重庆400016 重庆医科大学公共卫生学院 重庆400016
  • 【刊 名】《第三军医大学学报》2009年 第4期 297-300页 共4页
  • 【关键词】人端粒酶催化亚单位 启动子 自杀基因 克隆 基因治疗 靶向 卵巢癌
  • 【文 摘】目的构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和融合型自杀基因Fcy::Fur的重组真核表达质粒并探讨它对卵巢癌细胞的体外杀伤作用。方法①从pORF5-Fcy::Fur质粒中PCR扩增Fcy::Fur片段,亚克隆进p2XEB质粒,构建含hTERT启动子和Fcy::Fur基因的重组真核表达质粒p2XEB-Fcy::Fur;同理,将Fcy::Fur亚克隆进pGL3-Promoter质粒,构建含猿猴病毒40(SV40)启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒pGL3-Pro.Fcy::Fur,重组子经酶切鉴定、测序;②RT―PCR检测卵巢癌细胞SKOV3和人胚肺成纤维细胞MRC-5中hTERT mRNA的表达,荧光素酶活性分析检测hTERT启动子在2种细胞中活性;③用超声微泡作载体,将上述2种质粒分别转染SKOV3和MRC-5,与前药5.氟胞嘧啶(5-FC)共培养后,CCK-8测定转染细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色观察细胞凋亡;RT―PCR检测Fcy::Fur mRNA的表达。结果p2XEB-Fcy::Fur和pGL3-Pro-Fcy::Fur2种重组质粒酶切和测序结果与预期完全相符,hTERT启动子和Fcy::Fur片段测序与GenBank报道一致,且插入方向正确;SKOV3和MRC-5中hTERT mRNA表达分别为阳性和阴性,hTERT启动子在SKOV3中活性为26.2%,在MRC-5中为0.65%;p2XEB―Fcy::Fur/5-FC系统对SKOV3的增殖抑制率明显高于MRC-5(P=0.036),而pGL3-Pro-Fcy::Fur/5-FC系统对2种细胞的增殖抑制率无明显区别(P=0.87);转染pGL3-Pro-Fcy::Fur的SKOV3、MRC-5细胞以及转染p2XEB-Fey::Fur的SKOV3细胞,均见大量凋亡细胞和Fey::Fur mRNA表达,而转染p2XEB―Fcy::Fur的MRC-5少见凋亡细胞,也无Fey::Fur mRNA表达,与前三者比较,差异有统计学意义(P〈0.01)。结论含人端粒酶逆转录酶启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒p2XEB―Fcy::Fur成功构建,p2XEB―Fey::Fur,/5-FC系统能靶向杀伤端粒酶逆转录酶阳性的卵巢癌细胞。
 
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  • (1) 人端粒酶催化亚单位,启动子,自杀基因,克隆,基因治疗,靶向,卵巢癌
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