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细胞样本的前处理

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  • 更新日期:2015-11-27
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【细胞样本的前处理】详细介绍
 一、匀浆介质

 

一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。

二、细胞样本的前处理:

1、细胞沉淀的收集:

① 悬浮细胞: 对于悬浮培养的细胞,直接通过离心收集细胞沉淀,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀。

② 贴壁细胞: 对于贴壁培养的细胞,用胰酶将细胞消化下来,或用细胞刮将细胞刮下来,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀。

我们一般建议客户,细胞密度最好不要小于一百万个/ml。

2、细胞沉淀的洗涤:

在细胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS (等渗), 轻轻颠倒混匀,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀。

重复上述操作反复洗涤1~2次。

3、匀浆的方式:手工匀浆,超声破碎,裂解液裂解,反复冻融。

① 手工匀浆:在细胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变,一般加入0.5ml,细胞密度不小于一百万个/ml),混匀,将细胞悬浮于PBS中,用移液器将细胞悬浮液移至玻璃匀浆管中(2ml玻璃匀浆管),将玻璃匀浆管置于冰水混合物中,手动匀浆3分钟,然后取破碎好的细胞悬浮液进行测定。

② 超声破碎:

在细胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变,一般加入0.5ml,细胞密度不小于一百万个/ml),混匀,将细胞悬浮于PBS中,在冰水浴条件下进行如下操作:

     a、用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用400安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。

      b、用超声细胞破碎仪,300W功率,每次超声3~5秒,间隔30秒,重复4~5次。

③ 裂解液裂解 

常用裂解液有SDSNP-40TritonX-100,这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。

1、SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。

2、NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。

去垢剂属性只是一方面,buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素

由于很多裂解液都是蛋白变性剂,对酶活力的测定有一定的影响,一般不推荐用裂解液进行裂解。

④ 反复冻融:

在细胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变,一般加入0.5ml,细胞密度不小于一百万个/ml),混匀,将细胞悬浮于PBS中,放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右)。

                由于反复冻融对酶活力影响较大,一般不推荐使用

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